ВЕТЕРИНАРНЫЕ ПРЕПАРАТЫИнфекция MYCOPLASMA SYNOVIAE при вакцинации кур от ньюкаслской болезни цыплят.
Краткий обзор
Симптомами болезни Ньюкасла является нарушение дыхания, сопровождаемое нервными расстройствами и/или расстройством пищеварения. Для профилактики данного заболевания используется вакцинация живыми аттенуированными (лентогенными штаммами) и/или убитой вакциной. Использование штаммов со сниженной вирулентностью может привести к сильной реакции в результате прививки, в основном из-за присутствия других патогенных агентов. Среди прочих, Mycoplasma synoviae имеющая мировое распространение, особенно часто встречающаяся в Бразилии. Этот агент широко распространяется среди домашней птицы из-за сложности диагностирования и распространения болезни, различия вирулентности между разными штаммами M. synoviae, и того, что типичные симптомы заболевания M. synoviae приписывали действию других болезнетворных агентов. Это экспериментальное исследование на SPF цыплятах (Gallus gallus) предварительно зараженных M. synoviae и после привитых против Ньюкаслской болезни, было проведено с целью исследования патогенности M. synoviae путем оценки поствакцинальной респираторной и серологической реакций на противовирусную вакцину против Ньюкаслской болезни, после прививки в отсутствии факторов влияния окружающей среды. Всего были использованы 86 цыплят в возрасте 3 дней, из них 57 были заражены каплями в глаза и нос, штаммом M. synoviae активированным для цыплят WVU 1853. Через 7 дней, 21 цыпленок, зараженный микоплазмой, и 29 не зараженных цыплят были привиты против Ньюкаслской болезни. В результате, не зараженные и привитые птицы имели значительно более сильный и продолжительный серологический ответ на вакцинацию против Ньюкаслской болезни, чем зараженные и привитые. Зараженные и привитые птицы, также, имели меньшую серологическою реакцию против M. synoviae чем те, которые были заражены только микоплазмой. У привитых птиц дыхательной реакции после прививки не наблюдалось.Микоплазмы являются микроорганизмами класса Mollicutes известных взаимодействием с другими инфекционными агентами и факторами влияния окружающей среды, которые могут усилить тяжесть микоплазмоза. MG и MS могут вызвать хроническое респираторное заболевание, заболевание верхних дыхательных путей, в особенности у кур; инфекционный синусит у индеек, вызванный MG; инфекционный синовит вызванный MS, и аэросаккулит вызываемый MG, MS и M. meleagridis (MM). Тем не менее, хронические и симптоматические инфекции являются наиболее распространенными и значительными в связи с потерями, которые они приносят. Некоторые виды микоплазмы могут серьёзно повлиять на кладку яиц, их качество и вылупление, а также увеличение смертности, снижение эффективности переработки корма и набора веса. Также возможно изъятие тушек, в основном из-за аэросаккулита. Инфекция вызываемая MS часто характеризуется отсутствием клинических симптомов, или только легкой формой респираторного заболевания, хотя в 1970-х и 80-х гг самой распространенной формой инфекции был синовит и артрит. Случаи синергизма были зафиксированы среди MS и других инфекционных агентов. Распространение и изменение поведения были замечены при наличии инфекционных агентов, таких как вирус инфекционного бронхита, вирус ND, Influenza АEscherichia coli, MG и MS. Их взаимодействие описано как синергетический патогенный эффект.
Введение
За последние 30 лет, производство домашней птицы в Бразилии является важной частью сельского хозяйства, и достигло высокого уровня производительности. В настоящее время, самые требовательные иностранные рынки сбыта признают стандарт качества и санитарную безопасность мяса Бразильских бройлеров. Для гарантии поставки продуктов и субпродуктов домашней птицы должного санитарного качества, министерство сельского хозяйства, животноводства и продуктов питания Бразилии проводит контроль и/или ликвидацию птичьего микоплазмоза и Ньюкаслской болезни (ND) среди прочих заболеваний.
По всему миру, респираторные заболевания остаются одной из основных проблем отрасли разведения домашней птицы, и среди них микоплазмоз и вирусные заболевания, такие как ND связаны с большими экономическими потерями. Кроме того, это может служить барьером для торговли птичьими мясными продуктами и субпродуктами, так как эти болезни являются болезнями, подлежащими регистрации согласно Всемирной организации здравоохранения животных – OIE болезнь Ньюкасла является одним из наиболее серьезных типов парамиксовируса 1 серотипа рода Avilavirus относящихся к разряду Paramyxovirine, семейство Paramyxoviridae. Некоторые виды птиц восприимчивы к инфекции вируса ND, самыми чувствительными из которых являются куры, индейки и фазаны. В зависимости от вирулентности штамма ND, у зараженных птиц могут наблюдаться симптомы нарушения дыхательной и/или пищеварительной системы. В мировом масштабе ND передаваемая штаммами низкой вирулентности является энзоотической для Азии, Африки, центральной Америки и части Южной Америки, и представляет постоянную угрозу промышленности производящей птичьи мясные продукты. Вирулентные штаммы ND связаны с большими экономическими потерями в связи с высоким уровнем заболеваемости и смертности, снижения кладки яиц и поражения верхних дыхательных путей и пищеварительного тракта.
В Бразилии, с 1995 года не было зарегистрировано случаев вспышек ND на коммерческих птицефермах. В 1997 году заражение вирулентным штаммом ND было зафиксировано в штате Сан-Паулу от импортированных страусов; следующий случай был зарегистрирован в 1999 году в штате Парана от завезенных экзотических птиц. В последнее время заболеванием страдали дворовые куры, случаи заражения были замечены в Рио-де-Жанейро (RJ) Гойас (GO) в 2000 и 2001 годах соответственно, затем в 2006 в Рио Грандэ до Суль (RS), на Амазонке (AM) и Мато Гроссо (МТ). Эти вспышки заболевания среди дворовых кур в RJ, GO, RS, AM и MT были расценены OIE как незначительные для международной торговли птичьими продуктами и субпродуктами, таким образов они не повлияли на экспорт Бразилии. Тем не менее, страны, являющиеся членами OIE, обязаны сообщать о случаях ND на их территории.
Профилактика ND производится усилением гигиены и применением жестких мер биологической безопасности, а также регулярными прививками. Несмотря на то, что экспортируемые из Бразилии бройлеры считаются свободными от возбудителя ND и то, что места разведения птиц находятся далеко от регионов, которым свойственна эта болезнь, вакцинация поощряется с целью предотвращения заражения цыплят подверженных вирусу ND.
Использование живой аттенуированной и/или инактивированной вакцины против ND зависит от типа птицы и уровня риска заражения. Живая вакцина, производимая из штаммов ND со сниженной вирулентностью имела большой успех, но эти штаммы, в особенности Ла-Сота и Хитчнер В1 могут вызвать клиническое заболевание, с характерными признаками нарушения дыхательной функции, при введении птицам зараженных другими респираторными агентами. Бирд и Брах предполагают, что эти реакции, проявляющиеся после вакцинации, могут быть уменьшены, если выбирать штаммы и способ вакцинации основываясь на присутствии или отсутствии Mycoplasma gallisepticum (MG) и/или Mycoplasma synoviae (MS) у птиц.
Согласно последним поправкам, внесенным в нормативы Бразилии, птицезаводчики обязаны гарантировать отсутствие MG, MS и/или М. meleagridis, вне зависимости от вида птицы. К заводчикам третьего класса производящим бройлеров и цыплят предназначенных для торговли, требование гарантии отсутствия MS не применяется. Некоторые производители птицы и ветеринары считают, что MS безвредно для домашней птицы. Тем не менее, это мнение может быть основано на трудности репродуцирования MS заболевания среди кур, ошибках при диагностировании и широком распространении; вариации вирулентности у различных штаммов MS проявлений типичного MS заболевания. В результате, контроль и искоренение M. synoviae игнорировалось, позволяя его распространению среди домашних птиц по всему миру.
Это экспериментальное исследование было проведено на SPF цыплятах, предварительно зараженных MS и затем привитых против Ньюкаслcкой болезни с целью оценки патогенности MS путем оценки респираторных и серологических реакций на вакцину против Ньюкаслcкой болезни после вакцинации без воздействия факторов окружающей среды.
Материалы и метод
Активация M. synoviae
Перед началом настоящего исследования, штамм типа MS WVU 1853 (ATCC 25204) были размножены три раза в питательной среде Фрейя и затем привиты SPF цыплятам в возрасте 12 дней. Птицы были заражены через трахею 0,1мл бульона культуры MS, содержащего 1х109 единиц меняющих цвет/мл (CCU)|mL. Через 7 дней, MS были добыты из трахеальных мазков с использованием питательной среды Фрея и чашки с агаровой средой. Штамм типа MS был клонирован, и его идентичность была подтверждена иммунопероксидазным тестом, перед использованием в экспериментальном инфицировании.
Экспериментальный план
Всего 96 SPF цыплят породы леггорн в возрасте 1 дня (BIOVET S/А, Vargem Grande Paulista, SР, Бразилия) были использованы как описано в таблице 1.
Таблица 1.
План эксперимента и процедуры.
| Возраст (дни) | Процедуры | Экспериментальные группы | Получение образцов | Диагностический подход |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Взятие крови | Nd | Сыворотка | Серология MS/MG и NDV |
| 3 | Ms ифицирование | Nd | Nd | - |
| 10 | Взятие крови Аутопсия Определение групп Вакцинация против ND |
Nd MSI; MSI-NDVC; NDVC MSI-NDVC; NDVC |
Сыворотка Легкие, трахея Nd Nd |
Серология Молекулярное определение (PCR) (17dpi) |
| 17 | Взятие крови Аутопсия |
MSI; MSI-NDVC; NDVC MSI-MSI; NDVC |
Сыворотка Легкие, трахея |
Серология MS/MG (14 dpi) NDV (7dpv) МS Молекулярное определение (PCR) (14dpi) |
| 24 | Взятие крови Аутопсия |
MSI; MSI-NDVC; NDVC MSI-MSI; NDVC |
Сыворотка Легкие, трахея |
Серология MS/MG (21 dpi) NDV (14dpv) МS Молекулярное определение (PCR) (21dpi) |
| 31 | Взятие крови Аутопсия |
MSI; MSI-NDVC; NDVC MSI-MSI; NDVC |
Сыворотка Легкие, трахея |
Серология MS/MG (28 dpi) NDV (21dpv) МS Молекулярное определение (PCR) (28dpi) |
| 38 | Взятие крови Аутопсия |
MSI; MSI-NDVC; NDVC MSI-MSI; NDVC |
Сыворотка Легкие, трахея |
Серология MS/MG (35 dpi) NDV (28dpv) МS Молекулярное определение (PCR) (35dpi) |
| 45 | Взятие крови Аутопсия |
MSI; MSI-NDVC; NDVC MSI-MSI; NDVC |
Сыворотка Легкие, трахея |
Серология MS/MG (42 dpi) NDV (35dpv) МS Молекулярное определение (PCR) (42dpi) |
MS - Mycoplasma synoviae; MG - Mycolpasma gallisepticum; NDV - вирус Ньюкаслской болезни птиц; dpi - дней после инфицирования MS; dpv - дней после ND вакцинации; Nd — вакцинация против ND не проводилaсь; MSI – группа птиц зараженная MS.; MSI-NSVC – группа птиц зараженных MS. и привитых от ND; NDVC – группа привитых птиц против ND.
Затем выбранные в случайном порядке цыплята, в возрасте 1 дня, были отобраны, у них была взята кровь, и подтвержден отрицательный результат по MS и MG путем агглютинации сыворотки (SPA) с использованием коммерческого антигена (BIOVET S/A, Vargem Grande Paulista, Sp, Бразилия). Реакция антигенного комплекса SPA была завершена после гомогенизации антигена и сыворотки и вращения и встряхивания этих реагентов в стеклянной чашке в течение нескольких минут. Появление сгустков агглютинации указывает на положительную реакцию, в то время как появление прозрачного гомогената считается отрицательной реакцией. Затем при помощи стандартной процедуры с использованием микротитрационных планшетов и четырех единиц антигена гемагглютинации был проведен тест торможения гемагглютинации для подтверждения отрицательного статуса цыплят по вирусу.
В возрасте 3 дней 57 цыплят из оставшихся 86 были заражены штаммом MS активированным для цыплят каплями в глаза и в нос по 0,1 мл бульона содержащего MS культуру во втором пассаже (1х1010единиц меняющих цвет/мл), по 0,025 мл на глаз и на носовое отверстие. Были отделены двадцать девять цыплят не зараженных MS.
Через семь дней, когда цыплятам было по 10 дней, 29 незараженных и 21 MS зараженный цыпленок были привиты против ND через носовое отверстие по 0,03мл на птицу, в соответствии с инструкциями производителя живой вакциной против ND шт. Ла-Сота (BIOVET S/A, Vargem Grande Paulista, Sp, Бразилия).
В день вакцинации от ND, птенцы были разделены на три экспериментальные группы следующим образом: (а) MSI, 21 птица, зараженная MS); (b) MSI-NDVC, 21 птица, зараженная MS и привитая от ND (c) NDVC 29 птиц не зараженных MS, но привитых от ND вакциной.
Все экспериментальные группы были размещены в отдельных, изолированных помещениях, принадлежащих Экспериментальному животному отделению Лаборатории Животной Биологии / PESAGRO – RIO. Рекомендации по уходу за животными во время проведения исследований соблюдались, а также этические нормы при исследованиях на животных.
Серология и определение M.synoviae
Все цыплята ежедневно обследовались на предмет присутствия клинических симптомов и смерти в возрасте от 3 до 45 дней, по восемь цыплят были выбраны в случайном порядке из групп MSI, MSI-NDVC и NDVC для наблюдения. В возрасте 10 дней цыплята были отобраны перед вакцинацией против ND. У цыплят взяли кровь и по три цыпленка из групп MSI, MSI-NDVC и NDVC были вскрыты после наступления смерти, при этом образцы легких и трахеи были использованы для молекулярного определения MS при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полученные образцы сыворотки и органов были собраны и помещены для хранения в колбы при температуре -20ºС до использования.
Обработка образцов для ПЦР была произведена с использованием 1мл размороженного гомогената, после чего было произведено центрифугирование на мини-центрифуге (15000об/20мин, при 10ºС), во время которого c супернатант было удалено а осадок, примерно 40мг, использован для получения ДНК путем очистки ДНК при помощи фенол/хлороформа согласно Sambriik и другие. Копирование ДНК было произведено в термоцикле РТС-100 (электротермический эффект Пельтье, ML Reearch, Inc.) Были использованы четыре циклические процедуры: нагревание до 94ºС/3минуты (ДНК разделяется), затем 39 циклов при 94ºС в течение 1 минуты (денатурация), затем 52ºС /1 минута (ренатурализация) и 72ºС/2 минуты (экстензия), затем последующая экстензия при 72ºС/5 минут и охлаждение при 4ºС/10 минут. В каждую реакционную пробирку Эппендорфа было помещено: 52мл воды Milli-Q, Gibko BRL; 10мл ПЦР 10Хбуффера Gibko BRL; 5мл MgCl2; 5мл смеси DNTP (0,25мл от каждого DNTP), 4мл (100pmol) MSL (5’GAGAAGCAAAATAGTGATATCA 3’) и такое же количество праймера MSR (5’CAGTCGTCTCCGAAGTTAACAA3’) TRIS-EDTA (TE) Taq (CENTBIOS-lot 1309, RS, Бразилия), что вместе составило 100мл, которые были покрыты двумя каплями минерального масла. Положительный контроль ПЦР был получен с MS шт. WVU 1853 бульонной культурой, а отрицательный со штаммом типа MG (АТСС 19610) при таких же условиях. Ампликоны наблюдались после электрофореза в агарозном геле и маркировки бромистым этидием в ультрафиолетовом свете.
Все образцы сыворотки были дезактивированы нагреванием до 56ºС/30минут, для уничтожения неспецифических ингибиторов, и протестированы на MS и MG антигенным комплексом. В случае неразбавленной сыворотки с положительной реакцией, было произведено последующее разведение от 1:5 до 1:160, причем титр 1:10 или выше считался положительным результатом. Соотношение сероположительных птиц в каждой группе в день сбора было получено и проанализировано путем теста хи-квадрат с уровнем значимости 5%. Для иммунной реакции на вакцинный вирус ND птиц, был применен HI –тест и анализ геометрически средним титром (GMT) log2 причем титр равнялся 4.0 или выше указывал на защищенность. Впоследствии, полученные данные были проанализированы при помощи теста статистической значимости с 5% уровнем значимости.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Штамм MS был получен путем ПЦР из образцов легких и трахеи всех цыплят зараженных MS. У положительного контроля наблюдался ожидаемый ампликон 250 пар оснований, а у отрицательного контроля полосы увеличения не было.
Все зараженные MS цыплята были слабыми и страдали от депрессивного состояния в течение oт четырех до пяти дней после заражения MS (dpi), в то время как 21,0% (12/57) из них умерли. Тем не менее, ни у одной из этих птиц не наблюдалось признаков нарушения дыхания или артрита. После прививки против ND птиц, ни у одного из привитых цыплят не наблюдалось респираторных проблем. Трое из привитых цыплят умерли по не взаимосвязанным причинам, один иp них был из группы MSI-NDVC и умер через два дня после вакцинации (dpv); и двое из группы NDVC - через четыре и пять дней (dpv) соответственно.
Образцы сыворотки полученные от цыплят в возрасте 10 дней, предопределением тестовых групп, были изменены на сероконверсию к МS, при помощи SPA в соотношении 50,0% (4/8) и 20% (2/8) соответственно, для неразведенной и разведенной сывороток (Tаблица 2). Все образцы сыворотки были отрицательными по MG антителам. Образцы сыворотки, полученные у цыплят из группы NDVC в возрасте от 17 до 45 дней были отрицательными по SPA для MS и MG антител, как показано в Tаблице 2. В тот же период, SPA уровень положительных антител в разведенной и неразведенной сыворотках к MS у цыплят из группы MSI-NDVC был значительно ниже (р<0,05), чем в группе MSI по тесту хи-квадрат как показано в Tаблице 2.
Таблица 2.
Процент сероположительных по антигенному комплексу M. synoviae (MS), SPA в не разведенной (UD) и разведенной (D) сыворотках и GMT/HI (log2) к вакцинному вирусу Ньюкаслcкой болезни птиц (ND) в группе зараженной M. synoviae (MSI), в группе зараженной MS и привитой против ND (MSI-NDVC) и в группе не зараженной MS, но привитой против ND (NDVC).
| Возраст (дни) | Dpi | Dpv | Экспериментальные группы | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| MSI | MSI-NDVC | NDVC | |||||||||
| SPA (%)* | HI (GMT) | SPA (%) | HI** (GMT) | SPA (%) | HI (GMT) | ||||||
| UD | D | UD | D | UD | D | ||||||
| 10 | 7 | - | 50.0ª | 20.0ª | 0 | Nd | Nd | Nd | Nd | Nd | Nd |
| 17 | 14 | 7 | 90.0ª | 60.0ª | 0 | 66.7 b | 22.3 b | 0 | 0 | Nd | 0 |
| 24 | 21 | 14 | 55.6ª | 56.6ª | 0 | 22.3 b | 11.2 b | 4.5ª | 0 | Nd | 5.0 b |
| 31 | 28 | 21 | 50.0ª | 50.0ª | 0 | 20.0 b | 10.0b | 3.2ª | 0 | Nd | 5.0 b |
| 38 | 35 | 28 | 37.5ª | 25.ª | 0 | 22.3 b | 0 b | 0ª | 0 | Nd | 4.8 b |
| 45 | 42 | 35 | 20.0ª | 0ª | 0 | 16.7 b | 0 b | 0ª | 0 | Nd | 3.2 b |
Геометрическое значение титров/HI на вирус ND у цыплят из группы MSI-NDVC, за тот же период было значительно ниже (р<0,05) чем у цыплят из группы NDVC по тесту статистической значимости, как показано в Tаблице 2.
ИССЛЕДОВАНИЕ
В настоящем исследовании, инфицирование SPF цыплят в возрасте 3 дней MS штаммами WVU 1853, каплями в глаза и носовые отверстия не вызвало нарушения дыхательных функций или артрита у птиц, возможно в связи с генетическими различиями. Salisch и другие не выявили клинических признаков и повреждений, но получили высокие серопозитивные показатели – 70% при проведении теста на SPA у естественно зараженных взрослых особей кур. Kawakubo и другие ввели SPF цыплятам в возрасте 28 дней MS шт. WVU 1853 через носовые отверстия и через 14 дней после инфицирования, заметили у птиц отек тибиотарзального сустава, который спал через несколько дней. Lockaby и другие инфицировали SPF цыплят в возрасте 1 дня через лапки тем же штаммом MS и наблюдали клинические признаки и серьезные повреждения суставов, характерные для заболевания вызванного MS, через 14 и 21 день после инфицирования, соответственно.
Определение штамма MS при помощи ПЦР в образцах легких и трахеи зараженных цыплят являлось быстрой и точной процедурой, что также было отмечено Lauerman и другие и Salisch и другие. После вакцинации против ND, нарушений дыхательной функции ни у одной из групп обнаружено не было.
Тест на SPA, проведенный с целью оценки реакции иммунной системы на инфекцию MS был выбран благодаря его большей эффективности по сравнению с HI-тестом, как говорилось в предыдущих исследованиях проведенных Ghzzikhanian и другими, Ortiz и Kleven Ewig и другими. Резкое снижение сероконверсии к MS у цыплят из группы MSI-NDVC явственно определялось этим тестом, в противоречие результатам полученным Lockaby и другими, в чьeм эксперименте у всех птиц от 7 до 14 дней после инфицирования результаты тестов на SPA и HI были отрицательны по MS. Возможным объяснением этого может быть использованный этим исследователем способ заражения через лапки.
Серологические реакции птиц из группы MSI были значительнее чем у птиц из группы MSI-NDVC. Эти результаты согласовываются с Wyeth, который использовал тот же штамм MS через спрей на цыплятах в возрасте 42 дней. При использовании способа заражения через лапки Wyeth обнаружил повреждение суставов, сильную серологическую реакцию, и слабое распространение штамма MS. Принимая во внимание, что все цыплята зараженные MS заболели, полученные результаты согласуются с результатами, полученными Ewing и другими, когда процент сероположительных титров HI и GMT|HI титры к вакцине ND у цыплят подвергнутых заражению штаммом MS высокой вирулентности К3344 и вакцинации ND были ниже, чем полученные при использовании штаммов MS низкой вирулентности.
Согласно Alexander и Paulillo и Doretto, чувствительные цыплята, которым был привит штамм ND Ла-Сота со сниженной вирулентностью, считаются защищенными, когда геометрическое значение титров / HI (log2) антител достигает значения равное 4.0 или выше. В настоящем исследовании, у цыплят, которым была привита только одна доза, наблюдалось GMT / HI (log2) титр 5.0, которое снизилось до 4.8 в дни с 14 по 28 после вакцинации. Цыплята, которые был заражены штамм MS и привиты против ND через 7 дней после этого, достигли максимального показателя - 4.5, который упал до 0 (нуля) за тот же период, что указывает на необходимость повторной вакцинации, если бы речь шла о коммерческих цыплятах. В заключение, это экспериментальное исследование показало, что вакцинация против ND цыплят, предварительно зараженных MS, может быть подвергнуто опасности из-за нарушений в иммунной системе, подтверждая патогенность MS.
БЛАГОДАРНОСТЬ
Выражение благодарности ”EMBRAPA” Институту Исследований в области Агрикультуры Бразилии и “CNPq” Национальному Совету по Научному и Технологическому Развитию за предоставленную финансовую поддержку. BIOVET S/A, Vargem Grande Paulista, SP Бразилия за предоставление SPF цыплят, вакцины и антигенов использованных в настоящем исследовании.